Neue Technologien für die Elektrophorese

Nov 10, 2023

Angelo DePalma ist ein freiberuflicher Autor und lebt in Newton, New Jersey. Sie erreichen ihn unter [email protected].

Die Ende der 1980er Jahre entwickelte „Lab-on-a-chip“-Idee zielte darauf ab, das Äquivalent eines kompletten Analyselabors auf streichholzschachtelgroßen Platten aus Silizium, Glas und Kunststoff zu schaffen. Die meisten dieser Geräte basierten auf der Kapillarelektrophorese, einem Analysemodus, der bei mikrofluidischen Analysegeräten nach wie vor vorherrschend ist.

Der Traum, auf einem Substrat in Streichholzschachtelgröße etwas zu bauen, das einem ganzen Labor ähnelt, wurde nie verwirklicht, aber es sind kommerzielle Geräte entstanden, die eine unkomplizierte Elektrophorese auf Chips durchführen. Diese dienen überwiegend den Lebenswissenschaften, einschließlich der medizinischen Diagnostik. Ein Marktforschungsbericht geht von einer robusten jährlichen Wachstumsrate für solche Systeme von sieben Prozent aus.

PerkinElmer bietet zwei mikrofluidische Elektrophoreseplattformen an – den LabChip® GX Touch™ Nukleinsäureanalysator für DNA und RNA und das LabChip® GXII Touch™ Proteincharakterisierungssystem für Proteine ​​und Glykane. Beide Systeme bieten Hochdurchsatzplattformen für die elektrophoretische Trennung, Größenbestimmung und Quantifizierung von Biomolekülen. PerkinElmer hat spezielle Mikrofabrikationsmethoden entwickelt, die Kanäle mit geringer Mikrometergröße in dünne Glas- und Quarz-Mikrochips einbetten. Die Mikrochips sind über Kunststoffbehälter mit dem Instrument verbunden, um ein einfaches Laden der Probe und den Einsatz in der Instrumentierung zu ermöglichen.

„Die Hauptvorteile der mikrofluidischen Biomolekülanalyse im Vergleich zur gelbasierten Biomolekülanalyse sind Durchsatz, Auflösung, Benutzerfreundlichkeit, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit“, sagt James Atwood PhD, General Manager für Automatisierung und Mikrofluidik bei PerkinElmer. „Die herkömmliche Gelelektrophorese ist zeitaufwändig, arbeitsintensiv, anfällig für Schwankungen und verbraucht große Mengen wertvoller Proben.“

Mikrofluidik-basierte LabChip-Assays verbrauchen nur 150 Nanoliter Probe pro Trennung und sind mit Nukleinsäure- und Proteinproben im niedrigen pg/μL- bzw. ng/ml-Konzentrationsbereich kompatibel. Der Durchsatz von bis zu 384 Proben pro Zyklus für LabChip übersteigt bei weitem den von gelbasierten Systemen und Biomolekülen, wie z. B. N-verknüpften Glykanen, die nicht für die Trennung auf Elektrophoresegel-Basis geeignet sind, aber in mikrofluidischen Systemen getrennt und nachgewiesen werden können. Ein weiterer wichtiger Vorteil der mikrofluidischen Biomolekültrennung ist die Trennung und Quantifizierung nativer Proteine ​​allein auf der Grundlage der Ladung, um Ladungsvarianten zu erkennen. Die gelbasierte Elektrophorese kann Proteinladungsvarianten nicht auflösen.

Bei typischen gelelektrophoresebasierten Massenspektrometrie-Arbeitsabläufen werden die Verbindungen zunächst im Gel getrennt und dann die Banden herausgeschnitten, die den interessierenden Biomolekülen entsprechen. In proteomischen Arbeitsabläufen werden Proteine ​​enzymatisch abgebaut und Peptidfragmente vor der LC-MS/MS aus dem Gel extrahiert. Obwohl dieser Ansatz eine Reihe von Vorteilen hat, einschließlich der Tatsache, dass es sich um einen orthogonalen Trennungsmodus handelt, ist er äußerst mühsam.

Es wurden mehrere mikrofluidische Systeme entwickelt, die die direkte Kopplung eines mikrofluidischen Chips mit einem HPLC-System und einem Massenspektrometer ermöglichen. In diesen Mikrochromatographiesystemen sind die Mikrofluidikkanäle mit einer stationären Phase gefüllt, die für den gewünschten Trennmodus spezifisch ist. Dies ermöglicht die automatisierte Erfassung und/oder Trennung von Biomolekülen direkt auf dem Chip mit Elution, Ionisierung und Detektion im Massenspektrometer. Im Gegensatz zu gelbasierten Ansätzen sind die Mikrochromatographiesysteme automatisierungsfreundlich und können durch Modifizierung des Packungsmaterials so angepasst werden, dass sie gezielt auf bestimmte Biomoleküle abzielen.

Die mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer-System verwendeten Chips bestehen aus einem Kunststoffbehälter mit 16 Vertiefungen, die für die Reagenzien- und Probenaufgabe verwendet werden. Jeder Chip ist mit Identifikatoren für den Testtyp, der Chargennummer und dem testspezifischen Chip-Setup gekennzeichnet. Der Glaschip enthält geätzte Mikrokanäle und ist auf die Rückseite des Caddys geklebt. „Der Produktionsprozess des Glaschips und des Trennkanals ähnelt dem von Halbleiterbauelementen“, sagt Eva Graf, Produktmanagerin für Bioanalysatoren bei Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Agilent verwendet für Protein- und Nukleinsäurechips spezielle Schutzmasken, die die Kanalstruktur widerspiegeln. Wenn die Glassplitter dem Ätzmittel ausgesetzt werden, werden nur die Kanäle in das Glas geätzt. Die verbleibende Chipoberfläche wird durch die Maske geschützt.

Das Mikrokanalsystem verbindet alle Wells des Caddys mit dem Injektionskreuz und dem Trennkanal. Vor dem Auftragen der Proben werden die Mikrokanäle mit einer Mischung aus Trenngel und Fluoreszenzfarbstoff gefüllt. Während des Chipdurchlaufs wird in mehreren Schritten eine Hochspannung angelegt, entsprechend einem versuchsspezifischen Skript, das die Anordnung der Mikrokanäle im Glaschip widerspiegelt. „Das Skript koordiniert die Vorentnahme, die elektrokinetische Injektion und natürlich die elektrophoretische Trennung der Proben“, erklärt Graf. „Die gleichzeitige elektrophoretische Trennung und Vorentnahme der nachfolgenden Probe reduziert die Analysezeit auf Minuten pro Probe.“ Getrennte Analyten werden dann innerhalb des Trennkanals durch laserinduzierte Fluoreszenz nachgewiesen und das Signal wird in gelartige Bilder und Elektropherogramme übersetzt.

Die Elektrophorese auf einem Chip ermöglicht eine hochauflösende Trennung, die nur ein minimales Probenvolumen erfordert, was die Technologie für die Qualitätskontrolle wertvoller Proben vor jeder nachgelagerten Anwendung attraktiv macht.

Zu den wichtigsten Elektrophorese-Chip-Anwendungen von Agilent gehört die Qualitätskontrolle von Bibliotheken in Sequenzierungs-Workflows der nächsten Generation. Laut Graf ist die genaue Berechnung der Größenverteilung und der Probenkonzentration vor der Sequenzierung entscheidend für das Erreichen einer optimalen Clusterdichte, und die Beurteilung der Menge und Qualität des experimentellen Ausgangsmaterials ist für den Forschungserfolg von entscheidender Bedeutung. „Bei der Verwendung von RNA als Ausgangsmaterial für die Genexpressionsanalyse mittels NGS, Microarrays oder qPCR ist der RNase-Abbau ein häufiger Grund für fehlgeschlagene Experimente. Mit den chipbasierten RNA-Assays lassen sich auch kleine Abbaueffekte und die RNA-Integrität einfach visuell erkennen.“ Anzahl ermöglicht eine objektive Probenqualifizierung.“

Im Gegensatz dazu ermöglicht die herkömmliche Gelelektrophorese nur die Abschätzung der Probenintegrität, die anfällig für benutzerabhängige Interpretationen ist. „Hohe Empfindlichkeit und ein großer linearer dynamischer Bereich der DNA-Assays machen es zu einem optimalen Werkzeug für die Analyse von durch PCR amplifizierten oder durch Restriktionsenzyme verdauten Fragmenten und ermöglichen eine einfache Bewertung der Spaltungseffizienz synthetisierter gRNA bei der Genombearbeitung“, sagt Graf.

Auf der Seite der Proteinanalyse bieten EPCs eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, analytische SDS-PAGE-Methoden zu ersetzen. Zu den typischen Anwendungen gehört die Beurteilung der Größe, Reinheit und Konzentration von Proteinen bei Prozessen wie der Expression rekombinanter Proteine, der Proteinreinigung, Stabilitätsstudien oder der allgemeinen Antikörperanalyse.

Laborleiter bewerten Instrumente anhand ihrer Fähigkeiten und nicht anhand ihres Buzz-Faktors. Käufer von Chip-basierten Systemen sollten daher sicherstellen, dass die in Betracht gezogenen Systeme die Tiefe und Breite der durchzuführenden Tests bieten.

Graf empfiehlt Systeme, die Assays „geeignet für Ihren Probentyp, insbesondere im Hinblick auf Probenkonzentration, Probengröße, Probentyp (DNA, RNA, Protein usw.)“ bieten, immer mit Blick auf den Probendurchsatz. „Berücksichtigen Sie auch die Dienstleistungen des Anbieters in den Bereichen Support, Garantie, Reparatur und Installation sowie die Benutzerfreundlichkeit des Systems, die alle dazu beitragen können, die Ausfallzeiten im Labor auf ein Minimum zu reduzieren.“

Probenvolumina sind bei allen Analysegeräten zu einem wichtigen Verkaufsargument geworden. Kleinere Volumina verbrauchen weniger Reagenzien und weniger Proben und ermöglichen es Forschern, mehr aus seltenen oder knappen Proben zu machen. Der 2100 Bioanalyzer von Agilent benötigt beispielsweise nur einen Mikroliter Probe für RNA- und DNA-Assays.

Die Einhaltung gesetzlicher Vorschriften ist für pharmazeutische Forschungs- und Entwicklungslabore ein Problem, wobei 21 CFR Teil 11 die geltende Regelung für elektronische Aufzeichnungen ist. Compliance spielt auch eine Rolle bei den Standardabläufen in Diagnoselabors und allen Einrichtungen, die ständig mit dem Patent- oder Rechtssystem interagieren, beispielsweise in der Forensik.

Die Kosten spielen immer eine Rolle, aber bei Instrumenten, die in Laboren täglich verwendet werden, müssen die Betriebskosten im Hinblick auf den Energie- und Reagenzienverbrauch berücksichtigt werden. Servicepläne sind in der Regel umfassend und bieten im Allgemeinen eine schnelle Reaktion, doch stark ausgelastete Labore sollten auch die wirtschaftlichen Auswirkungen von Ausfallzeiten berücksichtigen.